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日志

 
 

一个新的人NFBD1启动子的鉴定与分析  

2017-02-17 21:58:08|  分类: 抬头望见北斗星— |  标签: |举报 |字号 订阅

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【摘要】  目的: 鉴定分析NFBD1启动子,为进一步研究其转录调控奠定基础. 方法: 综合应用生物信息学分析和异构体特异性的巢式RTPCR技术鉴定NFBD1转录起始位点和转录变异体;高保真PCR方法扩增NFBD1基因启动子区域并分别定向克隆入pGL3basic和pGL3enhancer载体,构建NFBD1启动子荧光素酶报告基因重组体;荧光素酶分析检测启动子活性;生物信息学方法预测转录因子结合位点. 结果: 鉴定了一个新的NFBD1转录起始位点和转录变异体,构建了2个含有长度分别为2.5和1.2 kb的NFBD1启动子序列的荧光素酶报告基因重组体以及2个相应的含有外源增强子的NFBD1启动子荧光素酶报告基因重组体. 启动子活性分析表明,该启动子区域具有启动子活性,且能被外源增强子有效驱动,是一个新的人NFBD1启动子. 转录因子结合位点预测分析表明,该启动子区域缺乏典型的CCAAT盒和GC盒,但含有TATA盒以及STAT1, MZF1和MAZ等潜在的转录因子结合位点. 结论: 鉴定了一个新的NFBD1启动子.  
【关键词】  NFBD1 启动区(遗传学) 增强子元件(遗传学) 转录调控 
     0引言 
    NFBD1(a nuclear factor with BRCT domain 1),也称MDC1(mediator of DNA damage checkpoint protein 1),是一个参与细胞内DNA损伤后细胞应答反应的重要分子[1-2]. 目前国内外NFBD1的研究几乎全部集中在NFBD1在DNA损伤应答通路中的作用研究,尤其是NFBD1和ATM, Chk1等重要信号分子之间的相互作用及其生物学意义的研究,而对NFBD1转录调控的研究则鲜有报道[1]. 事实上,NFBD1自身表达水平的变化也是决定DNA损伤后细胞的存活和凋亡的重要因素[3]. 本研究在我们前期对NFBD1转录调控研究的基础上,综合应用生物信息学分析和特异性巢式RTPCR技术鉴定了一个新的NFBD1转录起始位点和转录变异体,并对其相应的启动子区域进行了克隆鉴定和初步功能分析. 
    1材料和方法 
    1.1材料人宫颈癌细胞系HeLa,人非小细胞肺癌细胞系A549和人成骨肉瘤细胞系U2OS为本实验室保存,HeLa和U2OS采用DMEM培养基培养, A549采用RPMI培养基培养,两种培养基均添加FBS和青霉素(1×105 U/L)/链霉素(100 mg/L),培养于CO2培养箱. DMEM, RPMI, 胎牛血清, Lipofectamine 2000和反转录试剂购于Invitrogen公司;pGL3basic vector, pGL3enhancer vector和DualLuciferase Reporter Assay System购自Promega公司. RNeasy Mini Kit, QIAquick Gel Extraction Kit和QIAprep Spin Miniprep Kit购自QIAGEN公司. 
    1.2方法 
    1.2.1生物信息学分析从GenBank等国际基因数据库提取NFBD1的cDNA和基因组序列,用在线BLAST程序进行序列比对,得出NFBD1基因外显子和内含子的构成. 同时以NFBD1 cDNA的5′端序列用BLAST程序对人EST数据库进行在线联机分析,收集高度同源性的EST序列并进行拼接,以对NFBD1 cDNA 5′端进行电子延伸(BLAST程序网址为http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). 根据cDNA 5′端序列电子延伸的结果预测NFBD1的转录起始位点. 用TFsearch等软件对启动子区域进行转录因子结合位点分析,寻找潜在的转录因子结合位点. 采用DNAMAN软件进行简单的序列比对和限制性酶切位点等简单的序列分析. 
    1.2.2RNA提取和RTPCR 
    1.2.2.1RNA提取收集正常传代生长的HeLa和A549细胞,参照RNeasy  Mini Kit说明书提取细胞总RNA. 利用紫外分光光度计定量并计算A260/A280,1.0%Agilent 2100 Bioanalyzer检测其质量以确保RNA的完整性. 以NFBD1 cDNA 5′端序列电子延伸结果为依据,采用Primer Premier 5.0软件设计了三条PCR引物. 引物名称和序列分别为:F1,5′AGTTTTCTCTGTTCGACTAC3′;R848,5′CATTCTTCCCGAGGTGT3′;R739,5′ATTGCTCTGTCTCCTCCTC3′. 其中F1的核苷酸序列对应于第一外显子,R848对应于第二外显子,R740对应于第三外显子. 
    1.2.2.2反转录取3~5 μg总RNA,加1  μL  3 g/L随机引物,DEPC双蒸水补足至12 μL,65℃温育15 min,冰上冷却后依次加入2 μL DEPC水, 6  μL 5×第一链合成缓冲液, 6  μL 0.1 mol/L DTT, 3 μL 10 mmol/L dNTPs和1 μL逆转录酶(2×105 U/L)于42℃温育5 min,于42℃温育90 min,95℃ 5 min终止反应,cDNA产物原液直接用作PCR模板. 
    1.2.2.3巢式PCR第一次PCR扩增的反应体系组成为5 μL 10×PCR缓冲液,4 μL 10 mmol/L dNTPS, cDNA模板1 μL, 0.5 μL Taq酶(5×103 U/L)、引物10  μmol/L F1和R848各1 μL,双蒸水补足至50 μL. 扩增程序为:95℃变性2 min,然后用逐步程序95℃ 20 s, 60℃ 20 s, 72℃ 30 s完成40个循环,最后于72℃延伸7 min. 第二次巢式PCR扩增:取第一次扩增产物,用TE稀释20倍. 按以上程序扩增1 μL稀释产物,但仅进行20个循环. 用QIAquick Gel Extraction Kit 10 g/L琼脂糖凝胶纯化回收巢式PCR扩增产物,直接用ABI 3710DNA测序仪双脱氧法全自动测序. 
    1.2.3启动子报告基因重组体的构建 
    1.2.3.1NFBD1基因5′端侧翼区的扩增采用Primer Premier 5.0软件分别设计3条携带限制性酶切位点的引物,名称和序列分别为:F1,5′ACCGAGCTCGCCCTGATTAGTCGATGC3′(划线部分为SacI位点);F2,5′GGGGTACCTGAGGGAACATCAACTTGTG3′(划线部分为KpnI位点);R1, 5′CTAGCTAGCTGGAGAACAGCCCGTAG3′(划线部分为NheI位点). 以正常人胎盘基因组DNA为模板,分别用F1/R1和F2/R1为引物组合,采用高保真PCR扩增NFBD1基因转录起始位点5′端上游区域的2个长度分别为2485和1180 bp的基因组片段. 高保真PCR扩增反应体系为:5 μL 10×PfuUltra Buffer, 4  μL 10 mmol/L dNTPs, 10 μmol/L上下游引物各2.5 μL, 50 ng 正常人胎盘基因组DNA, 1 μL PfuUltraTM Taq酶(2500 U/L),双蒸水补足至50   μL. 扩增程序为:95℃变性2 min,然后用逐步程序95℃ 30 s, 65℃ 30 s, 72℃ 1~2.5 min完成30个循环,最后于72℃延伸10 min. 
    1.2.3.2启动子报告基因重组体的构建用QIAquick  Gel Extraction Kit 10 g/L琼脂糖凝胶分别纯化回收扩增产物,分别用KpnⅠ/NheⅠ或SacⅠ/NheⅠ双酶切后,用QIAquick  PCR Purification Kit纯化回收酶切片段,克隆入pGL3basic载体,构建含NFBD1 5′调控序列和荧光素酶报告基因的重组质粒,分别命名为P22485b和P21180b. 然后采用亚克隆方法,将这两个片段克隆入pGL3enhancer载体,分别命名为P22485e和P21180e. 重组质粒均经限制性内切酶酶切鉴定和测序确认. 
    1.2.4瞬时转染质粒瞬时转染采用Lipofectamine 2000试剂进行,方法参照试剂使用说明书,略有改动. 转染前1 d,将细胞以1×105/孔接种至12孔培养板,细胞生长密度至80%左右时进行转染. 每组设置3个重复,同时共转染入10 ng pRLTK质粒(包含海肾荧光素酶基因),作为内参对照. 
    1.2.5荧光素酶报告基因活性检测转染48 h后,采用DualLuciferase  Reporter Assay System进行荧光素酶报告基因活性检测,方法参照试剂使用说明书,略有改动. 每孔细胞先用1×PBS洗2次,加入250 μL 1×细胞裂解液,室温120 r/min摇床摇15     min后,收集细胞裂解液,离心去除细胞碎片. 用化学发光检测仪Luminometer TD20/20检测荧光素酶活性,取细胞裂解液上清20 μL加入荧光素酶检测试剂II(LARII)100 μL,测量萤火虫荧光素酶活性,然后继续加入Stop&Glo试剂,将上述反应猝灭,并同时启动海肾荧光素酶反应,测量海肾荧光素酶活性.
    2结果 
    2.1生物信息学本研究中,我们以生物信息学方法为主要手段,以KIAA0170序列为基础,进一步对人EST数据库进行BLAST多序列比对同源性分析,对该序列进行电子延伸和拼接. 其中以BP216855为代表的多个EST序列均和KIAA0170 5′端序列高度同源,从而将KIAA0170在5′端进一步延伸了635 bp(图1). 在和BP216855序列对应的基因组序列上游35 bp处,又发现一保守的转录起始序列元件CCAGTTT[4],其中A为转录起始位点,进一步将KIAA0170在5′端又延伸了35 bp. 由此我们通过生物信息学分析鉴定了一个新的NFBD1选择性转录剪接变异体(图1),该变异体全长为7609 bp,对应的基因结构则为由15个外显子和14个内含子组成(图1). 新发现的第一内含子以GT开始,以AG结束,遵守GT/AG剪接规律
    2.2NFBD1新转录变异体的鉴定以F1R848为引物组合对来自A549和HeLa细胞的cDNA模板进行的首轮PCR扩增均得到了预期的848 bp的片段,以该产物为模板以F1R739内侧引物组合进行的第二轮同样得到了预期较短的739 bp的片段(图2).  这3条引物分别对应于不同的外显子区域,说明了该PCR片段不是来自基因组模板污染造成的扩增,而是确实来自于cDNA模板的扩增. 进一步对该PCR产物进行测序,发现该PCR片段确实来自NFBD1基因. 该基因序列已经提交并被GenBank数据库接受,注册号为EF177823. 
    M1:  100 bp分子质量标准; 1:  F1R848引物组合(A549细胞); 2:  F1R848引物组合(HeLa细胞); 3:  F1R739引物组合(A549细胞); 4:  F1R739引物组合(HeLa细胞); M2:  1 kb分子量标准.
 图2NFBD1新转录变异体巢式PCR产物电泳图谱 
    2.3NFBD1启动子报告基因重组体的构建对转录起始位点上游的序列用启动子预测软件进行分析,结果显示该部分区域确实是一个潜在的启动子区域,继而又对该部分序列进行了转录因子结合位点预测. 进一步设计3条引物,采用高保真PCR对NFBD1基因5′端侧翼区转录起始位点上游两个片段进行扩增,均得到了预期的约2.5 kb和1.2 kb的片段(图3). 分别采用KpnⅠ/NheⅠ和SacⅠ/NheⅠ双酶切后,克隆入pGL3basic和pGL3enhancer载体,构建NFBD1启动子荧光素酶报告基因重组体. 重组质粒酶切鉴定结果见图4. 所有克隆均经直接或(和)引物步移法测序确认序列正确无误. 
    2.4NFBD1启动子活性分析将构建好的各NFBD1启动子报告基因重组质粒分别转染A549, HeLa和U2OS细胞,以本研究室前期鉴定和构建的NFBD1基因启动子报告质粒P11530作为对照,同时转染pRLTK质粒作为内参对照. 通过检测萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶活性的比值,来表示不同启动子片段的活性. 启动子活性分析表明,与不含任何启动子的pGL3basic空载体相比,P11530具有非常高的启动子活性,而P22485 和P21180启动子活性相对很低(图5A). 将P22485 和P21180所含的启动子片段亚克隆入含有外源SV40增强子的pGL3enhancer载体后,启动子活性在HeLa细胞系中均被外源SV40增强子显著提高至10~20倍(图5B),在U2OS和A549中也得到类似结果(数据未示). 这些结果提示,前期鉴定的P11530启动子是NFBD1的主要启动子区域,而本研究鉴定的这一新启动子为一新的活性较低的NFBD1基因启动子. 
    3讨论 
      高等动物包括人都有一系列面对各种外源(如太阳辐射等理化因素)和内源(如体内产生的自由基等有害物质)DNA损伤的分子应答机制,包括细胞周期检测点(cell cycle checkpoints), DNA修复和细胞凋亡等,以及时修复损伤,确保基因组的遗传稳定性. 如果细胞不能对DNA损伤进行有效处理并保持基因组遗传稳定性,将可能造成基因突变进而导致癌症等疾病[5]. 
      NFBD1即是一个参与DNA损伤后的细胞应答通路的重要分子[1-2]. 在2003年,来自美国和英国的三个研究小组同时在同一期Nature杂志发表论文,揭示了NFBD1在DNA损伤检测点(DNA damage checkpoint)信号转导途径中的重要作用[6-8]. 目前其基本功能已基本明确:NFBD1在DNA损伤后发生磷酸化,并和DNA损伤后修复和DNA损伤检测点信号途径中的多个蛋白相互作用,进而在核内形成nuclear foci,介导DNA修复或细胞凋亡[1-2,6]. 通过siRNA抑制NFBD1的表达,则导致细胞对DNA损伤试剂更加敏感,并出现细胞周期检测点缺陷和细胞凋亡[8]. NFBD1的表达水平在DNA损伤后期也出现显著下调,这在诱发依赖P53的细胞凋亡进程起着重要的作用[3]. 
      我们最近对NFBD1的主要启动子区域进行了研究,将NFBD1的主要启动子定位于一325 bp的区域(待发表数据),本研究鉴定的新启动子区域则位于这一主要启动子的上游. 有趣的是,前期鉴定的NFBD1主要启动子区域缺乏TATA盒,但含有典型的CCAAT盒和GC盒;而本研究鉴定的新启动子则含有TATA盒,而缺乏典型的CCAAT盒和GC盒[9]. 这就提示,这两个启动子可能在体内相互协调补充,从而最终实现NFBD1基因表达的精确调控. 有研究提示转录因子STAT1参与DNA损伤应答反应并可能参与NFBD1的表达调控[10-11],但我们在NFBD1的主要启动子区域没有发现高度保守的STAT1结合位点,而在这一新的启动子区域,发现了两个高度保守的STAT1结合位点(图4). STAT1是否通过这两个位点来调控NFBD1转录则有待进一步证实. 
      另外,前期鉴定的主要启动子对应有三个转录起始位点和三种转录变异体(GenBank数据库序列注册号分别为EF177820,EF177821和EF177822),而这一新启动子则对应一新的转录起始位点和转录变异体(序列注册号为EF177823).  同时我们的结果也表明,该新启动子可以被外源增强子有效驱动. 这一鉴定将为进一步深入研究NFBD1的基因表达调控奠定了良好的基础. 
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