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日志

 
 

RNA干扰在组织特异性靶向性基因治疗中的研究进展  

2017-02-24 15:47:24|  分类: 抬头望见北斗星— |  标签: |举报 |字号 订阅

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【摘要】    RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术是一种有效的基因沉默技术,由于其高度特异性、高效性以及稳定性等特点,RNA干扰技术在肿瘤基因治疗研究中得到了广泛的应用。靶向性基因治疗是肿瘤生物治疗的一个重要研究方向。本文以RNA干扰技术在靶向性基因治疗中的研究进展进行综述。

【关键词】  RNA干扰 靶向性基因治疗 DF3

  靶向性基因治疗是肿瘤生物学治疗中的一个重要方法,其中RNA干扰是一种在真核生物体中广泛存在的通过双链RNA分子在mRNA水平上诱导特异性序列基因部分表达或完全抑制的过程。是研究基因功能、新基因筛选、基因治疗和寻找药物靶点的重要工具。

  1  靶向性基因治疗

  靶向治疗重点在于“靶向”,既能高效准确地杀伤癌细胞同时对正常的组织细胞很少损伤或不损伤。现在主要的方法有靶向基因病毒治疗、抗体治疗、RNA干扰技术、肿瘤干细胞、小分子靶向药物和纳米技术等[1]。许多改造后的病毒能选择性的在肿瘤内复制导致细胞裂解死亡,有良好的靶向性,但是单用病毒治疗,有时会出现杀伤力不足抑制效率低等问题,结合基因治疗和病毒治疗的各自优势,刘新垣[1]运用了一种靶向基因病毒治疗的新策略。其中病毒以溶瘤病毒为例,溶瘤病毒载体携带靶向基因,此种病毒载体可靶向在癌细胞内复制数百倍到数千倍,而病毒载体复制的同时其携带的靶向基因也同样增加了数百数千倍,因此大大增强了基因的杀伤力和特异性。在常用的靶向基因治疗的方法中,RNA干扰是由一种短的双链RNA诱发的mRNA降解,这个现象发生在转录后水平,所以又称为转录后基因沉默。RNAi只降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA,具有很高的特异性和很高的效率。

  2 RNA干扰技术在靶向性基因治疗中的应用

  2.1 RNA干扰技术 
 
  RNA干扰技术是基因治疗中常用的重要技术之一。RNA干扰是由双链RNA引起的广泛存在于动植物中的序列特异性转录后基因沉默。作为高效、特异的调节基因表达的技术,已经成为基因功能研究的有力工具。RNA干扰现象与内源性的RNA降解有关,双链RNA能够非常特异的降解和其序列相应的单个内源基因的mRNA,但是对靶基因的内含子或者是启动子没有很明显的抑制效应,从而表现出高度的序列特异性,首先[2]是dsRNA在一种具有RNaseⅢ样活性的dsRNA特异性核酸内切酶(dsRNA specific endonuclease,Dicer)作用下,被酶切割成21~13nt的具有双链结构的小干扰RNA(siRNA),这些siRNA与一种称为RNA诱导沉默复合物(RNAinduced silencing complex, RISC)的蛋白结合,在ATP的作用下siRNA双链结构解旋并诱导形成有活性的RISC,在此有活性的沉默复合物的作用下,其通过碱基配对定位到同源mRNA上,并在距离siRNA 3'端的12个碱基的位置切割mRNA,实现降解目的mRNA的作用[3]。

  dsRNA能够非常特异的降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA,无关序列的基因表达无干扰作用,这就决定了RNAi有非常严格的序列特异性。而且RNAi以21nt siRNA为中间产物,在酶复合体作用下降解mRNA,产生作用后就与底物分离,继续与另外一个底物结合,如此循环往复,高效率的降解mRNA。因此少量的siRNA就能抑制基因表达,表明了siRNA的高效性[4]。siRNA分子是3'端有突出的非配对碱基的双链分子,在细胞内可稳定存在3~4天,半衰期长于寡聚核苷酸,有很高的稳定性。正是由于RNA干扰技术有严格的序列特异性、高效性和稳定性等特点,使其成为肿瘤基因治疗中的一个重要的方法。

  2.2 RNA干扰靶点的选择 

  在肿瘤的靶向治疗中,治疗靶点的选择尤为重要。据文献报道[5]近90%恶性肿瘤细胞和永生细胞有端粒酶活性表达,而且许多肿瘤细胞的端粒酶活性远高于那些高度增殖的正常细胞,甚至在一些肿瘤中端粒酶活性高低与恶性程度一致.端粒酶[6]是正常细胞向恶性肿瘤转化的关键性因子,端粒酶的活化被认为是肿瘤细胞永生化及无限增殖的重要环节。

  因此,端粒酶是肿瘤靶向治疗的一个重要的靶点,现今对端粒酶的研究已经相当丰富而深入,端粒酶[7]是由端粒RNA和蛋白质组成的核糖核蛋白酶,主要作用[8]是弥补随着细胞有丝分裂逐渐缩短的端粒长度,防止染色体DNA降解、末端融合缺失和非正常重组,避免染色体融合和遗传信息的不稳定,避免细胞分裂停止及细胞衰老的发生,使某些增殖旺盛的细胞和肿瘤细胞的端粒保持动态平衡。

  除了在肿瘤细胞中有端粒酶,在各种癌旁组织、癌前病变组织细胞中也都广泛存在。由于绝大多数肿瘤细胞都具有端粒酶活性,所以,抑制端粒酶活性为手段的基因疗法,对肿瘤有很强的广谱性和针对性。以端粒酶作为肿瘤基因治疗的靶点,已经在多种人类肿瘤如乳腺癌、胃癌、膀胱癌中有所尝试:用基因敲除的方法对相关基因进行抑制,从而降低端粒酶活性、促进肿瘤细胞凋亡。有研究者[9]通过光化学细胞内陷方式将针对hTRET的裸核酸肽导入到前列腺癌细胞DU145的细胞质中,通过光线照射后,60%~70%的端粒酶活性受到抑制,细胞的生长抑制率为57%~73%,贲勇等[10]利用人端粒酶逆转录酶的小干扰RNA(siRNA)特异性的抑制乳腺癌细胞MCF7细胞的端粒酶逆转录(Human Telomerase Reverse Transcrip tase ,HTERT),抑制细胞生长,导致细胞凋亡,而且还能下调多个细胞永生化基因。 
    
  端粒酶RNA(Human Telomerase RNA,hTR)是端粒酶的三个亚基之一,赵丽[11]等学者将针对人类hTR基因的反义寡核苷酸(ASODN)作用于细胞,发现能有效抑制乳腺癌MCF7细胞的生长,降低端粒酶活性并诱导细胞的凋亡。赵家明[12]通过研究发现,未经修饰的脱氧核酶(DZT)和在DZT的3末段添加倒位连接T碱基的脱氧核酶(DZTi)在体外能有效切割hTR,人工合成的脱氧核酶也能高效特异地切割hTR,并降低乳腺癌细胞的端粒酶活性。高金波[13]等用与HTERT mRNA互补的反义寡核苷酸作用于乳腺癌细胞,结果发现乳腺癌细胞端粒酶活性明显受到抑制,细胞的增殖能力也降低,并且可以诱导细胞凋亡。郭华雄[14]等通过实验研究证实端粒酶的活性和bcl2/bax比值有关,随着bcl/bax比值的增加,端粒酶活性增加,两者有明显的正相关,而且bcl/bax比值变化可能早于端粒酶活性的变化,可以从这个角度考虑抑制HTERT去抑制乳腺肿瘤。研究显示,通过抑制端粒酶活性,能有效的抑制肿瘤细胞的生长,而且,可以通过不同的方法来抑制端粒酶的活性,都能使端粒酶的活性有效的降低,抑制肿瘤细胞的生长。此外,有研究表明[15]我们常应用于肿瘤治疗的放疗,也能降低小鼠乳腺癌细胞端粒酶的活性,而且有剂量依赖效应。

  2.3 组织特异性靶向性RNA干扰的实现 

  很多的研究表明抑制端粒酶能很好的抑制肿瘤细胞的生长,端粒酶为有效的作用靶点。但是,设计的siRNA只是针对端粒酶,而有端粒酶活性的细胞在人体的很多正常组织中也有存在,比如:胚胎组织、正常成年男性生殖细胞、炎性细胞、造血干细胞、更新组织的增生细胞(如上皮的基底层细胞,肠隐窝等)等。尤其是在不同分化程度的癌组织其端粒长度不同,端粒酶活性表达程度也有所不同。因此,抑制肿瘤细胞的同时,也会对人体这些具有端粒酶活性的正常细胞和组织产生有效的抑制作用,如何能实现乳腺癌组织特异性而不抑制正常组织的端粒酶成为了关键的问题。也就是说只有把shRNA的表达特异地限定在肿瘤组织中,才能使以RNA干扰为基础的基因治疗真正地实现组织特异性。选择一些组织特异性的基因、相应的细胞因子或者启动子是实现这个要求的方法之一。

  DF3/MUC1抗原是一种相对分子量为290 000的粘蛋白样糖蛋白,是转录水平高度选择性表达的人乳腺癌相关抗原,在约80%的人乳腺癌细胞中存在着过度表达,由于这种过度的表达是基于转录水平的增高,具有较高的特异性。有学者[16]用免疫放射分析对乳腺癌肿瘤患者血清DF3水平的变化做了检测,发现其血清水平与乳腺癌肿瘤的恶性程度呈正相关,这就提示DF3基因的编码产物可能是乳腺癌十分重要的标志物,故DF3可以作为治疗乳腺癌的一个较好的靶分子。有研究证明[17]其转录调控序列598至485区可介导目的基因在DF3阳性的乳腺癌细胞中选择性表达,而其转录最大活性区间位于725至+31。
    
  蔡明,黄文广等[18],从组织特异性角度出发,应用肿瘤组织特异性的DF3启动子,构建含人乳腺癌DF3启动子转录调控序列和白喉毒素A片段(DTA)的重组表达载体PGL3DF3DTA,用阳离子聚合物基因转染试剂将重组表达载体瞬时转染DF3阳性的MCF7细胞和DF3阴性的MDAMB231细胞,转染后检测发现PGLDF3DTA对DF3阳性的MCF7细胞生长抑制率呈明显的上升趋势,而对DF3阴性的MDAMB231细胞生长无明显的抑制作用。另外,运用DF3阳性的MCF7细胞和DF3阴性的MDAMB231细胞分别制成细胞悬液接种于裸鼠皮下制作动物肿瘤模型,然后再用重组表达载体PGL3DF3DTA分别多点注射到所构建模型的移植瘤内,通过对肿瘤瘤体的生长速度、体积等方面的观察,发现由DF3阳性的MCF7细胞构建的模型在接受重组表达载体注射一段时间后,移植瘤生长明显延迟。而DF3阴性的MDAMB231细胞组移植瘤生长依然很旺盛。通过以上的实验,表明重组表达载体PGL3DF3DTA在DF3阳性的乳腺癌细胞中高表达,而且在体内外均能发挥特异性杀伤作用。由此可见运用组织特异性的启动子如乳腺癌特异性的启动子DF3,启动下游的RNA干扰序列,使组织特异性的RNA干扰成为可能。

  2.4 RNA干扰技术(siRNA)存在的问题 

  我们已经知道,RNA干扰是由双链RNA分子介导的,特异性识别互补mRNA,经过酶切实现转录后基因沉默,这个技术被广泛的接受和运用。通常情况下是由Pol Ⅲ(如H1和U6)启动子驱动下游表达发夹结构RNA,然后再经过核酸酶RnaseⅢ家族中的Dicer酶切割成长为21bp的双链siRNA,最终特异识别切割mRNA。但是,Pol Ⅲ启动子缺乏肿瘤特异性,在构建载体时把Pol Ⅲ型启动子换成具有组织特异性的polⅡ型启动子,可能会导致polⅡ型启动子不能启动下游的RNA干扰序列,这个缺陷成为RNAi在肿瘤靶向性治疗中的一个障碍。而miRNA的发现,则成功的解决了这个问题。

MiRNA是一类新发现的非编码小RNA分子,通常在转录后水平调控基因表达。miRNA的合成是一个多步骤并受精细调控的生物学过程。首先,miRNA基因在RNA聚合酶Ⅱ的参与下转录生成primiRNA,转录合成的primiRNA多含有数kb核苷酸序列[19],后者经酶切生成premiRNA。miRNA基因首先转录产生几百至几千nt的初级产物(primiRNA),在核内被切为70nt左右的发夹状前体(premiRNA),其在RNAGTP和转运蛋白Exportin5的协同作用下转运出核,经Dicer酶切割成约22nt的成熟的双链miRNA,双链中的一条与RNA诱导沉默复合物结合,然后结合到靶基因mRNA的3UTR,降解靶mRNA或阻遏其转录后翻译。miRNA由polⅡ型启动子调控表达,若参照内源性miRNA的框架设计siRNA,就能够采用polⅡ型启动子介导RNA干扰,运用polⅡ型组织特异性启动子调控RNAi成为可能。

   Silva J M[20]等利用mir30骨架构建了针对人和鼠基因组的14000个shRNA表达质粒,即第二代shRNA文库。这样构建以polⅡ型启动子调控microRNA为骨架的siRNA表达系统,其基因沉默效率比传统的siRNA表达方法有显著提高。利用诸如人端粒酶hTERT启动子、肝癌的甲胎蛋白AFP启动子等组织特异性启动子,调控siRNA的表达,将会广泛应用于RNAi介导的肿瘤基因治疗,以达到高度肿瘤特异性沉默靶基因或组织特异性RNA干扰的目的。
    
  以miRNA为骨架构建的表达载体和传统的siRNA在分子特征、生物合成、和作用机理上都比较相似[21]:(1)都是有1925个作用的核苷酸组成;(2)都需要Dicer酶或者类似的RnaseⅢ的加工;(3)都是由双链的RNA前体加工而成;(4)都是通过与RNA诱导沉默复合体结合发挥作用;都可以在转录后水平抑制靶基因的表达。

   但是二者有以下的区别[22]:(1)siRNA是在RNAi过程中形成的中间体,即siRNA是在病毒感染或者人工插入dsRNA后诱导而成,而miRNA是细胞内RNA的固有组分之一;(2)他们来源不形同,siRNA来源于转基因或病毒RNA,miRNA来源于内源转录;(3)siRNA是由长dsRNA转变而来的,miRNA是由具有发夹结构的premiRNA转变而来的;(4)siRNA主要以双链形式存在,其3'端存在2个非配对的碱基通常为UU,miRNA主要以单链形式存在;(5)Dicer酶对两类RNA的加工过程不同,miRNA为不对称加工,仅来自dsRNA前体的一条链,而siRNA是对称来源于dsRNA前体的两条链,所以成熟miRNA是以单链形式存在,而成熟siRNA是以双链形式存在;(6)siRNA与靶mRNA完全互补配对结合,引导RISC的形成,使它能够精确特异地在siRNA互补区域里剪切,导致目标mRNA降解。miRNA与靶RNA并不是完全互补,存在错配现象,引起翻译抑制,或者其它一些遗传调节,导致或者不导致目标RNA的降解。SiRNA的靶序列有一个核苷酸突变,就会影响到RNAi的沉默效果,而miRNA是不能完全识别的,也不会影响到miRNA途径的调节效应。

  3  RNA干扰靶向靶向基因治疗存在的问题和展望

  靶向基因治疗和RNA干扰的结合运用,是一个创新。siRNA和miRNA的发现,提示小RNA在生物体生长和调控中的重要作用,可能是生命活动的重要调节结构。尤其是miRNA的发现,是新近的研究方向,有研究提示miRNA与机体肿瘤的发生和抑制都有相关性,其作为类似于癌基因和抑癌基因的作用,参与细胞增殖、凋亡和分化的调控,而其作用机理和与肿瘤的更深入的关系,还有待更深入的研究。但是我们认为,RNA干扰在基因表达调控和基因功能的研究方面,有很重要的意义,而且必将极大的促进基因治疗的发展。今后,RNA干扰尤其是miRNA的研究将是研究的重点之一。

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