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日志

 
 

CR2DAF和DAFCR2靶向补体抑制物的构建、 表达与鉴定  

2017-02-24 16:20:53|  分类: 抬头望见北斗星— |  标签: |举报 |字号 订阅

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【摘要】    目的: 构建针对补体激活物的特异靶向补体抑制物, 并对其进行体外活性鉴定。方法: 将补体受体(CR2)与补体抑制物(促衰变因子, DAF)以融合表达方式(顺反结构)克隆到表达载体PBM中, 然后将重组体转移到CHO细胞中进行蛋白表达, 用SDSPAGE、 Western blot、 流式细胞术(FCM)检测、 SPR检测及补体介导的细胞溶解实验对表达的融合蛋白进行生物学活性鉴定。结果: SDSPAGE和Western blot结果显示出现预期大小的目标片段。FCM与SPR检测结果显示, 重组蛋白CR2DAF与DAFCR2能特异地与C3包被的CHO细胞、 C3dg配基相结合。补体介导的细胞溶解实验结果显示, 靶向补体抑制物比相应的非靶向补体抑制物的抑制效果明显(CR2DAF的抑制效率高达20倍)。结论: 成功构建了CR2DAF和DAFCR2靶向补体抑制物, 为下一步进行动物体内补体抑制实验奠定了基础。

【关键词】  CR2 促衰变因子 补体 抑制物

  补体是机体免疫系统的重要组成部分, 补体活化在机体抵抗微生物方面发挥着重要作用, 但在特定条件下它可以对宿主自身产生危害, 过度的补体活化在免疫复合物疾病和自身免疫综合征中发挥作用。干预这种不需要的补体活化是补体研究中的长期目标, 近年来取得了一定的进展, 如通过重组产生的补体调控蛋白(可溶性CR1)或人源化的抗C5 单克隆抗体(mAb),  已在临床上取得明显治疗效果[1, 2]。但CR1在抑制补体活化的同时也阻断了机体免疫系统中C3活化产物的产生, 从而存在一定的副作用。近年来, 人可溶性促衰变因子(decay accelerating factor, DAF)作为补体抑制物在炎症和生物不相容性疾病动物模型中体现出了一定的保护作用[3,   4]。直接将靶向补体抑制物定位至补体相关疾病位点的策略可能提高对补体的抑制效率, 同时可以避免由于系统性和长期性补体抑制带来的副作用。已有研究表明, 抗体DAF靶向融合蛋白比非靶向补体抑制物能更有效保护目标细胞[5]。C3激活片段是存在于补体激活位点处的调理素, 它们是不同C3受体的配基。CR2是C3的一个受体, 主要表达在B细胞和滤泡树突细胞上[6], 它在体液免疫中起着重要的作用。CR2由15或16个短同源重复序列(short consensus repeat, SCR)组成, 其天然配基是iC3b, C3dg和C3d[7]。这些配基一旦产生, 不仅能存活相对较长的时间, 而且在补体激活位点的浓度也较高[3]。因此, 拟采用可溶性CR2作为将DAF定位至补体相关疾病位置的载体, 从而构建一种更有效的靶向补体抑制物, 使其只对补体激活位点产生抑制,而不影响机体免疫系统正常的补体调节。

  1  材料和方法

  1.1  材料  表达载体PBM来源于缺失鼠IgG1 Fc编码区的p118m IgG1; CHO细胞用于蛋白表达, 其培养液为含100 mL/L胎牛血清的DMEM, 购自Invitrogen公司。鼠抗DAF mAb 1H4和1A10、 鼠抗人CR2 mAb 171、 抗羊红细胞IgM及所有二抗均购自Sigma公司。

  1.2  方法

  1.2.1  兔抗CHO细胞膜和人DAF的抗血清的制备  按照参考文献[8]介绍的方法获得。

  1.2.2  表达重组体的构建及蛋白表达  cDNA结构基因由编码CR2的4个N端SCR单位与编码DAF编码胞外区的序列相连接而成。补体抑制物序列是编码成熟DAF蛋白序列的1-249个碱基(Swissprot登录号为P08174)。然后将CR2与补体抑制序列连接,   CR2在N端时(CR2DAF)连接序列为SS(GGGGS)3, 在C端时(DAFCR2)连接序列为(GGGS)2。基因框架用PCR技术合成。所有克隆步骤均在PBM载体上进行。之后将重组体转移到CHO细胞中进行蛋白表达(具体步骤参照Invitrogen公司指导手册)。利用有限稀释法选择稳定转染的细胞克隆株。

  1.2.3  重组蛋白的纯化  利用亲和色谱法对细胞培养物上清中的蛋白进行纯化。按照操作手册,层析柱通过将抗DAF mAb(1H4)与HiTrap正常人血清(normal human serum, NHS)活化的亲和柱偶联而成。将含重组蛋白培养上清的pH值调至8.0, 以0.5 mL/min的速率过柱。然后以6~8倍体积PBS洗柱子, 重组蛋白以2~3倍柱体积的0.1 mol/L甘氨酸(pH2.4)洗脱。将融合蛋白收集到1 mol/L Tris缓冲液(pH8.0)中, 并在PBS中透析。

  1.2.4  SDSPAGE和Western blot鉴定  纯化的蛋白在含100 g/L的SDSPAGE胶中进行。凝胶用考马斯亮蓝染色。Western blot实验中用鼠抗DAF mAb 1H4对重组蛋白进行检测。

  1.2.5  FCM检测  CHO细胞在含100 mL/L抗CHO血清的培养液中培养, 用C3调理。在100 g/L C6depleted NHS中37℃作用45 min。经C3调理的CHO细胞用1 μmol/L的重组蛋白在4℃条件下进行洗涤、 孵育60 min。之后用10 g/L的抗DAF的mAb 1H4在4℃条件下孵育30 min。用FITC标记的二抗(1∶100) 4℃条件下孵育30 min。之后用含20 g/L多聚甲醛的PBS溶液进行洗涤、    固定。最后用FCM进行检测分析。所有的孵育与洗涤均在DMEM中进行。C3致敏结果用人iC3b特异性抗体进行FCM检测确认。

  1.2.6  CR2融合蛋白与C3配基相互作用动力学分析  CR2融合蛋白与生物素标记的C3dg(C3dg生物素)相互作用的动力学分析用表面细胞质基因组共振(SPR)检测系统进行检测(BIAcore 3000仪器)。按照每个流动细胞平均50 mg/L的量, 将人C3dg生物素[9]以2 μL/min的速度注射到BIAcore抗生物素蛋白链菌素传感器芯片上, 作用20 min, 缓冲液是0.5×PBS(pH7.4)(含有0.5 g/L Tween20)。从捕获的C3dg上获取的SPR信号产生BIAcore反应单位(范围是250到500)。以不加融合蛋白组作为对照。25℃, 以25 μL/min的流速, 用0.5×PBST(0.5 g/L Tween20)洗涤后, 通过检测CR2融合蛋白浓度(15.6~500 nmol/L)来评估其亲和力。

  1.2.7  补体溶解实验  为测定对补体的抑制活性, 60%~80%融合的CHO细胞用乙二胺四乙酸分开, 用DMEM洗2次, 然后重悬于DMEM中, 使其终浓度为109/L。在细胞悬液中加入100 mL/L兔抗CHO细胞膜抗血清, 4℃作用30 min, 使细胞致敏。然后弃抗血清, 细胞重悬于用DMEM稀释的NHS中, 终体积为50μL或100μL。37℃作用60min, 最后用胎盘兰染色排除法测量细胞成活力(活细胞与死细胞均计数)。重组蛋白用DEME稀释后先加入到NHS中, 再加入至CHO细胞悬液。终浓度以100 g/L NHS可导致大约90%抗体致敏的对照CHO细胞溶解为准。补体介导的红细胞溶解抑制实验用抗体致敏的羊红细胞(EAs)进行测定。溶血试验在明胶佛罗那缓冲液(GVB++)中进行, 终体积为300 μL, 包含有2.5×107 EAs, NHS按照1∶300稀释。反应混合物在37℃孵育60    min, 最后加入300 μL含10 mmol/L EDTAPBS溶液终止反应。离心, 取上清, 在413 nm波长下用光谱成像仪对上清中的血红素进行定量检测。

  2  结果

  2.1  重组蛋白的表达与纯化  从稳定转染的CHO细胞培养上清中分离到重组蛋白(CR2DAF, DAFCR2) 100~200 μg/L, SDSPAGE和Western blot结果显示出现预期大的小目标片段(图1)。

  2.2  融合蛋白对补体致敏细胞的靶向作用  FCM结果显示, 重组蛋白CR2DAF与DAFCR2连接到了C3包被的CHO细胞上, 而游离的DAF则没有。DAFCR2与C3CHO细胞的结合数量比CR2DAF高(图2)。

  图1  SDSPAGE与Western blot检测结果(略)

  M: 标准分子量marker; 1: 纯化的DAFCR2融合蛋白; 2: 纯化的DAFCR2融合蛋白.

 图2  FCM检测结果(略)

  2.3  融合蛋白与C3dg配基相互作用动力学分析  动力学分析数据显示,   用球形检测参数可达到1∶1(Langmuir)最适合接合反应模型(图3), 图中实线表示不同浓度的CR2融合蛋白, 从下至上浓度依次为15 nmol/L, 30 nmol/L, 62 nmol/L, 125 nmol/L, 250 nmol/L, 500 nmol/L; 虚线表示曲线与Langmuir结合模型的符合度。SPR检测结果显示, CR2在N端(CR2DAF)比其在C端(DAFCR2)有较高的结合与解离速率(图3,  表1)。而且CR2DAF的亲和力比DAFCR2高。CR2融合蛋白与C3dg的亲和常数在以往发表的数据范围之内。游离的DAF没有与固定的C3dg结合。

  图3  SPR检测结果(略)

  2.4  融合蛋白补体抑制物活性检测  补体介导的CHO细胞和红细胞溶解实验结果(图4)显示, 靶向补体抑制物比相应的非靶向补体抑制物的抑制效果明显, 而且CR2在N端(CR2DAF)比其在C端(DAFCR2)的抑制效果更为明显。从图4还可看出, 抑制50% CHO细胞溶解, CR2DAF的浓度为18 nmol/L, 而非靶向sDAF需要375 nmol/L, 差异高达20倍(表2)。另外, 在细胞溶解抑制实验中, sDAF对红细胞的保护作用要比CHO细胞强。

  图4  抑制补体介导的细胞溶解实验检测结果(略)

  表1  重组融合蛋白与C3dg生物素结合的动力参数(略)

  表2  能抑制50%细胞发生溶解的补体抑制物浓度(略)

  3  讨论
    
  以可溶性人DAF为补体抑制物, 以C3补体激活物的配基CR2作为靶向载体, 构建了靶向补体抑制物CR2DAF和DAFCR2。研究结果显示, 靶向蛋白比非靶向蛋白能更有效地抑制补体活化。在补体激活位点, 有大量C3分子的裂解产物沉积, 且多以共价形式结合。因此, CR2介导的靶向补体抑制物在治疗补体相关疾病(如类风湿性关节炎, 狼疮性肾炎等)方面有相当的潜力。
    
  DAF在N端和C端的抑制活性不同, 可能是由C3dg配基蛋白的结合特性所致。相比之下, CR2位于N端(CR2DAF)时的融合蛋白具有更强的补体抑制能力, 并且与C3dg的结合与解离速率均较高。这可能与细胞表面的移动性或补体抑制物的定向释放频率有关, 定向释放为补体抑制物提供了更多有利于结合的位置。CR2有15~16个SCR, 其N端第1、 2个SCR是其配体结合部分, 为了保障其结合区域的稳定性, 本研究选择了N端的4个SCR。而且在CR2与DAF的SCR域使用了一个相对较长的SerGly(丝氨酸甘氨酸)连接子, 这可能使得2个SCR与SCR之间发生折叠, 从而调整了CR2的结合活性[10]。    FCM检测结果表明DAFCR2比CR2DAF连接到C3CHO细胞上的数量多, 原因可能是由于融合蛋白对DAF结构域的改变, 从而影响了抗DAF检测抗体与DAF结合的能力, 此问题需要进一步研究分析。细胞溶解抑制试验中, sDAF和DAFCR2对羊红细胞的保护作用要比对CHO细胞的强。原因尚不清楚。推测可能与有核细胞自身的溶解特性有关。本实验中没有用人类细胞, 主要是考虑到在抑制内源性补体抑制蛋白的表达方面存在一定困难, 否则会使数据分析复杂化。以往研究中多用红细胞作为体外补体介导溶解实验中的靶细胞, 本研究结果显示CHO细胞作为此类实验的靶细胞似乎更具代表性。

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