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日志

 
 

巨噬细胞特异性启动子调控的真核表达载体的构建及靶向性研究  

2017-02-24 16:22:23|  分类: 抬头望见北斗星— |  标签: |举报 |字号 订阅

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【摘要】  目的: 构建巨噬细胞特异性启动子调控的靶向巨噬细胞的真核表达载体。方法: PCR方法合成巨噬细胞特异性启动子, 并将其插入带有绿色荧光蛋白(GFP)基因的真核表达载体pEGFPN1中, 替代CMV启动子。利用脂质体转染法, 将其与红色荧光蛋白真核表达载体(pERFPN1)共转染巨噬细胞和非巨噬细胞, 通过荧光显微镜观察GFP和RFP在不同细胞中的表达水平来鉴定启动子的靶向性。结果: 成功构建了巨噬细胞特异性启动子调控的真核表达载体, 并且能在巨噬细胞中高效特异性地表达报告基因。结论: 构建的靶向巨噬细胞的真核表达载体能提高目的基因的表达特异性, 为提高基因治疗胞内菌感染的靶向性及降低毒副作用奠定了实验基础。

【关键词】  巨噬细胞 细胞特异性 动子 真核表达载体 胞内菌感染 基因治疗

    胞内菌感染的治疗一直是临床上棘手的问题之一。常见的胞内感染细菌主要有结核杆菌、 伤寒沙门氏菌等。这些胞内感染菌突破人体第一道防线后, 在体内首先遇到巨噬细胞的吞噬和杀灭。然而在很多情况下巨噬细胞虽能吞噬这些细菌, 却并不能彻底杀死它们, 反而变成了胞内菌的庇护所[1]。另外, 由于大多数抗菌药在细胞内的浓度低, 导致胞内菌不能被有效杀灭, 而且胞内菌感染的治疗疗程长,  容易导致毒副反应的发生和耐药性的出现, 更使其治疗困难[2]。因此, 针对胞内菌感染的治疗, 新型抗菌药物和治疗方法的开发及应用显得尤其重要。我们前期成功构建了抗菌肽基因的真核表达载体, 并在小鼠巨噬细RAW264.7中成功表达了抗菌肽, 发挥了杀灭胞内菌的作用(待发表)。但是由于抗菌肽具有一定的毒副作用, 会对机体正常细胞产生损伤作用。为了减少抗菌肽对机体正常细胞的毒副作用, 增强目的基因表达的特异性和基因治疗的靶向性, 本研究中我们构建了巨噬细胞特异性启动子调控的靶向巨噬细胞的真核表达载体, 并利用绿色荧光蛋白(GFP)和红色荧光蛋白(RFP)作为报告基因研究了该启动子在不同种类细胞中表达的特异性。

  1  材料和方法

  1.1   材料 

  真核表达质粒pEGFPN1和pERFPN1为Clontech公司产品。大肠杆菌DH5α由本室保存。高保真聚合酶、 逆转录酶、 连接酶、 
DNA marker等购自大连TaKaRa公司。限制性内切酶Vsp I和Kpn I购自上海生工生物有限公司。胶回收试剂盒、 质粒提取和RNA提取试剂盒购自上海华舜公司。Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司。RPMI1640和DMEM培养基购自Gibco公司。其他试剂为国产分析纯试剂。小鼠巨噬细胞株RAW264.7、 人结肠癌细胞株Lovo、 人肝癌细胞株HepG2、 人乳腺癌细胞株ZR7530、 非洲绿猴肾细胞株COS7均由本室保存。

  1.2  方法

  1.2.1  引物的设计与合成及巨噬细胞特异性启动子的拼接合成  根据GenBank(登录号: DQ107382)和参考文献[3]报道的巨噬细胞特异性启动子序列设计拼接引物, 序列为P1:  5′GGCGCATTAATAAGCGACTTCCTCTTTCCAGCAGAAAAGGAGAAGTAGGAGCCAAGATTTCCAAACTCTGTGGTTGCCTTG3
′, P2:5′ACGAGCTCCTACTTCTCCTTTTCTGCTGGAAAGAGGAAGTCGCTTCTGGAAAGAGGAAGTCGCTTCAAGGCAACCACAGAGTTTGG3′, P3: 5′
ACGAGCTCCTACTTCTCCTTTTCTGCCAAGATTTCCAAACTCTGTGGTTGCCTTG3′, P4: 5′CTTCTCCTTTT
CTGCAGAAAAGGAGAAGTAGGAGCAAGGCAACCACAGAGTTTG3′, P5: 5′CTTTTCTGCAGAAAAGGAGAAGTAGGAGCTGGAAAGAGGAAGTCGCTTTACCCTCCC3′
, P6: 5′GAGGAAGTCGCTTTTGTCGCGGTCGGGACAGGGGGCAGGGAGGGTAAAGCGACTTCC3′, P7: 5′
GCGACAAAAGCGACTTCCTCTTTCCAGTGCATTTAAGGCGCAGCCTGGAAGTGCCAGG3′, P8: 5′GGGGTACCGCTAGCGACTGGGTGGCCTCCAGTGCTCCCTGGCACTTCCAGGCTGCG3′。其中划线处分别为为Vsp I和Kpn I的酶切位点, 引物由上海生工生物有限公司合成。以P1和P8为引物, P2~P7为模版通过PCR
方法拼接合成巨噬细胞特异性启动子序列, 反应条件如下: 98℃ 10 s, 68℃ 30 s, 共30个循环; 72℃ 5 min。扩增产物用10 g/L琼脂糖凝胶
电泳检测。

  1.2.2  巨噬细胞启动子的克隆及测序鉴定 
 
  PCR产物电泳后经胶回收试剂盒纯化, 与真核表达载体pEGFPN1用Vsp I和Kpn I进行双酶切, 酶切
片段回收后16℃连接过夜, 连接产物用氯化钙方法转化大肠杆菌DH5α, 菌落PCR方法筛选阳性菌落, 提取质粒进行双酶切鉴定, 并送测序。测序正确的载体命名为pSPGFP。

  1.2.3  细胞培养及转染  小鼠巨噬细胞株RAW264.7、 人结肠癌细胞株Lovo、 人肝癌细胞株HepG2、 人乳腺癌细胞株ZR7530、 非洲绿猴肾细胞株COS7用含有100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液, 在37℃50mL/LCO2孵箱中常规培养。转染前1 d铺24孔板, 次日将质粒pSPGFP和pERFPN1按摩尔比1∶1混合, 按转染试剂盒操作说明进行转染。48 h后用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的表达。

  2  结果

  2.1  结巨噬细胞启动子的拼接合成 

  通过拼接PCR方法合成了巨噬细胞特异性的启动子序列,   片段大小为350 bp左右, 与理论预测大小相符(图1)。

  2.2  巨噬细胞特异性真核表达载体的构建和酶切鉴定  PCR产物经双酶切后插入真核表达载体pEGFPN1, 替代CMV启动子得到重组表达载体。

  对重组载体进行Vsp I和Kpn I双酶切鉴定, 得到1条约350 bp的DNA片段(图2), 与理论预测值一致。经测序鉴定序列正确(测序图略), 命名为pSPGFP。

  2.3  转染重组质粒的细胞中GFP的表达 

  重组质粒pSPGFP与内参对照质粒pERFPN1按等摩尔比共转染各种细胞株。作为内参的报告基因RFP在各细胞株中均为高表达。GFP则仅在小鼠巨噬细胞RAW264.7中高表达, 表达强度与RFP相近; 而在其他非巨噬细胞中, GFP几乎没有表达(图3)。这说明我们构建的巨噬细胞特异性载体能够靶向巨噬细胞高效表达报告基因GFP。

 3  讨论

    采用基因治疗的方法来治疗胞内菌感染, 尤其是难治性胞内菌感染, 是一种新型有效的治疗策略。但是, 由于基因治疗的载体往往缺乏靶向性, 当载体进入机体后表达的目的基因往往会对正常组织细胞产生毒副作用, 造成机体损伤。所以, 基因治疗的靶向性是决定基因治疗成功与否的关键点之一, 也是目前基因治疗的研究热点[4]。

    巨噬细胞靶向性的基因表达的主要机制就是用巨噬细胞特异性的启动子来启动目的基因的表达, 使目的基因的表达仅限于巨噬细胞, 从而减轻其对正常组织细胞的损伤。现已广泛应用于动脉粥样硬化等[3, 5, 6]疾病的治疗研究。

    在本实验中, 我们合成了巨噬细胞特异性的启动子序列, 并以之替代pEGFPN1载体的CMV启动子, 成功构建了巨噬细胞特异性启动子调控的真核表达载体pSPGFP。通过转染巨噬细胞和多种非巨噬细胞, 观察GFP表达效率来验证该启动子的巨噬细胞靶向性。为了平衡各实验组间的细胞数、 细胞状态和转染效率等因素的差异对GFP表达的影响, 本实验中我们利用表达红色荧光蛋白的pERFPN1载体作为转染的内参照, 与重组载体共转染靶细胞, 通过比较GFP和RFP的表达差异来判断启动子的表达特异性。此方法比单独使用GFP[7, 8]更准确。而与利用海肾萤光素酶等作为内参照的双萤光素酶报告系统[9]相比, 该方法更简变、 更直观而且无需特殊的检测仪器。实验结果表明, 以巨噬细胞特异性启动子启动的GFP可以在巨噬细胞中高效表达, 在非巨噬细胞中则几乎没有表达; 而以CMV启动子启动的RFP在巨噬细胞和非巨噬细胞中均有表达。这说明我们构建的巨噬细胞特异性真核表达载体可以在巨噬细胞中特异性的表达目的基因, 为靶向巨噬细胞的基因治疗提供了新的思路和实验基础。

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