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日志

 
 

重组人腺病毒表达的MDV1 VP22蛋白的不同定位模式  

2017-03-07 22:14:55|  分类: 抬头望见北斗星— |  标签: |举报 |字号 订阅

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【摘要】  目的: 研究MDV1 CVI988 VP22蛋白的转导机制及细胞定位机理, 分析该蛋白在表达过程中细胞定位的影响因素。方法: 构建表达VP22蛋白的重组人腺病毒, 将重组病毒感染的AD293细胞裂解产物加至正常的MDBK细胞上, 通过免疫荧光(IFA)及Western blot鉴定VP22的蛋白转导功能。观察感染后不同时间VP22在AD293细胞上的定位, 并与瞬时表达的VP22蛋白定位比较。结果: 重组人腺病毒表达的VP22在MDBK细胞上能够进入几乎所有的细胞, 说明VP22蛋白具有很强的蛋白转导功能。进一步鉴定VP22的细胞定位发现, 在重组病毒感染的AD293细胞中, VP22首先聚集于细胞核周围, 随后以特殊的荧光粒子的形式散在于胞质中, 而AD293细胞中瞬时表达的VP22及MDV感染的CEF中VP22均均匀分布于细胞核。结论: 重组人腺病毒表达的VP22蛋白具有很强的蛋白转导功能, 不同重组病毒表达的VP22在细胞中的定位模式有所差别。

【关键词】  重组腺病毒; MDV1; VP22; 转导; 定位

  [Abstract] AIM: To study the transduction and localization mechanism of Marek’s disease virus serotype 1 (MDV1) CVI988 VP22 in different cells. METHODS: VP22 was expressed with recombinant adenovirus and identified by immunofluorescence assay (IFA) and Western blot. Lysates of recombinant virus infected 293 cells were added to normal MDBK cells to identify the transduction property of VP22. AD293 cells infected with recombinant virus were fixed to investigate localization of VP22 at different time post infection. Transient expression of VP22 in AD293 cells was carried out for control. RESULTS: The results showed that the VP22 expressed by recombinant adenovirus entered almost all the monolayer cells, which indicate the VP22 remains its transduction property. The VP22 first gather round the nucleus membrane, and then concentrated in particles in cytoplasm of 293 cells infected with recombinant adenovirus, compared with the nuclei localization pattern of VP22 in MDV infected CEF and transient expressed VP22 in 293 cells. CONCLUSION: The VP22 presented a different localization pattern in cells infected with different recombinant virus.

  [Keywords]recombinant adenovirus; MDV1; VP22; transduction; localization

细胞穿透肽(cell penetrating peptides, CPPs)是近年来发现的一类带正电荷, 能够穿越细胞膜和各类细胞器膜质结构的蛋白或多肽, 并具备温和、 高效等特点[1]。VP22是CPPs家族的主要成员之一, 具有独立的蛋白转导功能。Elliott等[2]发现, 瞬时表达的VP22在原始分泌的细胞中大部分集中于胞质, 而在转导的临周细胞则定位在细胞核; 然而在HSV感染的vero细胞中, VP22则首先在胞质中呈现特异的荧光斑, 随后逐渐向核膜聚集, 而后又向细胞膜运送, 最终在细胞间隙也能观察到VP22特异的荧光粒子。对于CPPs来讲, 细胞定位的不同决定了它们的应用范围和运用前景, 比如在DNA免疫方面, 表达的抗原分泌在胞外要比定位在胞内或细胞膜表面产生的抗原特异IgG的滴度高得多[3]; 而反义寡核苷酸也只有进入靶细胞的胞质时, 才能结合互补的mRNA链, 从而调节基因的表达[4]。所以, CPPs在转运不同物质时的细胞定位对其将来的应用是至关重要的。

  陈鸿军等[5]首先发现MDV1 CVI988的VP22蛋白同样具有蛋白转导功能, 并且在瞬时表达的COS1细胞及MDV感染的CEF细胞中均呈现明显的细胞核定位, 但是否该蛋白与HSV的VP22一样存在其他的定位模式, 决定该蛋白细胞定位的因素是什么现在还不明了。本实验旨在通过人腺病毒表达系统表达MDV1 CVI988 VP22蛋白, 研究不同表达体系中的VP22是否存在不同的细胞定位, 以期为深入探讨VP22的转导及定位机制提供实验数据。

  1 材料和方法

  1.1 材料 CVI988/Rispens疫苗株属于血清Ⅰ型MDV弱毒株, 由本实验室保存; AdGFP为表达绿色荧光蛋白的重组人腺病毒, 由本实验室自行构建; DH5α工程菌购于TaKaRa公司; 转化有pAdEasy1质粒的BJ5183AD1重组菌及XL10Gold工程菌购自Stratagene公司; AD293细胞为人胚肾细胞HEK293衍生株购自Stratagene公司; MDBK细胞为牛胚肾细胞。pShuttleCMV载体购自Stratagene公司; pcDNAVP22重组质粒为本实验室自行构建[6]; Kpn I和Xba I限制性内切酶均购自大连宝生物公司; Pme I和Pac I限制性内切酶购自New England Biolabs (NEB)公司; T4 DNA连接酶购于美国Promega公司; 质粒纯化和凝胶回收试剂盒均购于QIAGEN公司; Tryptone, Yeast extract来自OXOID公司; Lipofectin Reagent购自Invitrogen公司; 抗VP22单克隆抗体(mAb)4E12及3F7由本实验室自行研制[7]。

  1.2 方法

  1.2.1 表达VP22蛋白的重组人腺病毒的获得 (1)穿梭质粒pShuttleVP22的构建: 通过Kpn I和Xba I限制性内切酶将VP22基因从pcDNAVP22中切出, 经10 g/L琼脂糖凝胶电泳分离回收后连入以同样酶处理的pShuttleCMV载体, 按常规方法转化DH5α工程菌, 以Kpn I和Xba I酶切鉴定阳性克隆, 鉴定正确后命名为pShuttleVP22。(2)AdVP22重组人腺病毒载体的构建及扩增: 按常规方法小提pShuttleVP22重组质粒, 并以Pme I单酶切线性化后, 经10 g/L琼脂糖凝胶电泳分离回收, 以0.1 μg的量转化40 μL BJ5183AD1感受态细菌, 按常规提取粘粒的方法提取重组的人腺病毒基因组, Pac I单酶切鉴定, 以出现30 kb载体片段和3 kb或4.5 kb目的片段判定为阳性, 命名为pAdVP22, 将该重组载体以0.1 μg的量转化100 μL XL10Gold感受态细菌, 鉴定正确后大量提取重组质粒备用。(3)AdVP22重组人腺病毒的组装: 将5 μg量的pAdVP22用Pac I单酶切线性化后2倍体积乙醇沉淀后备用, 按照Invitrogen公司Lipofectin Reagent操作说明书将上述5 μg线性化的pAdVP22转染70%密度的AD293细胞, 37℃培养6 h后去除转染混合液, 并加入含50 mL/L小牛血清及青霉素、 链霉素各100 U的DMEM继续培养, 直至2周左右出现90%细胞病变后收集细胞, 反复冻融3次后离心以获取病毒上清, 将收获的病毒上清液继续感染ADAD293细胞, 传至第3代, 以空斑法测定病毒滴度。

  1.2.2 IFA及Western blot检测 将感染AdVP22重组病毒的AD293细胞以丙酮: 乙醇(3∶2)固定液4℃固定5 min, PBS洗涤干燥后按常规方法间接免疫荧光检测, 所用一抗为抗VP22mAb 4E12, 二抗为FITC标记的羊抗鼠IgG抗体; 收取感染AdVP22重组病毒的AD293细胞, 超声波裂解并加入SDSPAGE上样缓冲液煮沸处理后按常规方法[8]进行Western blot检测, 其中NC膜购自Amersham公司, 所用一抗为抗VP22mAb 3F7, 二抗为AP标记的羊抗鼠IgG抗体(Sigma), 显色用BCIP/NBT底物液。

  1.2.3 重组病毒表达的VP22转导功能的鉴定 收集感染AdVP22重组病毒的AD293细胞, 冰浴30Hz裂解2 min, 将裂解产物加至爬片的MDBK细胞上, 6 h后去除所加裂解产物, PBS洗涤3遍, 丙酮: 乙醇(3∶2)4℃固定5 min, PBS洗涤干燥后IFA检测, 随后加入碘化丙啶(50 mg/L)对细胞染核, 室温作用5 min, PBS洗涤后以Leica TCS SP2共聚焦显微镜观察VP22的细胞摄入情况。

  1.2.4 VP22在AD293细胞上的定位 以20 MOI的AdVP22重组病毒量感染AD293细胞, 分别于感染后12、 24、 36、 48 h固定检测, 同时以6 μg的pcDNAVP22重组质粒量转染AD293细胞, 换液后37℃继续培养72 h固定检测; 上述固定的细胞进行IFA实验后加入碘化丙啶(50 mg/L)进行细胞核染色, 并以Leica TCS SP2共聚焦显微镜Ar/ArKr 488和514双通道检测, 比较上述2组中VP22的细胞定位情况。

  2 结果

  2.1 AdVP22重组载体的构建 凝胶电泳分离并回收Kpn I和Xba I酶切处理的VP22基因片段, 连接入pShuttleCMV载体, 转化DH5α工程菌, 挑菌提取质粒DNA, Kpn I和Xba I酶切鉴定, 结果在732 bp处出现特异性条带(图1A), 说明重组穿梭质粒构建成功, 命名为pShuttleVP22, 将获得的pShuttleVP22重组穿梭质粒以Pme I单酶切线性化, 转化BJ5183AD1感受态细菌, 挑菌提取重组质粒后Pac I单酶切鉴定, 结果在3 kb处出现特异性条带(图1B), 说明携带VP22的重组人腺病毒载体构建成功, 命名为AdVP22。

  2.2 AdVP22重组病毒的获得及鉴定 将获得的pAdVP22重组质粒转化XL10Gold感受态细菌, 鉴定获得阳性细菌后大量扩增提取pAdVP22重组质粒, 将Pac I单酶切线性化的pAdVP22重组质粒转染AD293细胞, 约2周后细胞出现明显病变。将感染AdVP22重组病毒的AD293细胞固定后, 以抗VP22 mAb 4E12为一抗IFA检测VP22的表达, 结果出现特异性荧光染色, 说明成功获得AdVP22重组病毒, 且该重组病毒能够表达VP22蛋白。收集感染AdVP22重组病毒的AD293细胞裂解产物, 以抗VP22 mAb 3F7为一抗Western blot检测VP22的表达, 结果在相对分子质量(Mr)28 000处出现特异性条带(图2), 进一步证明VP22的表达。

 2.3 重组病毒表达的VP22具有蛋白转导功能 为证明重组病毒表达的VP22具有蛋白转导功能, 将AdVP22重组病毒感染AD293细胞, 在细胞开始出现病变时固定, IFA检测发现, VP22在感染的AD293细胞上呈现特异的辐射状荧光(图3), 而对照AdGFP则呈现点状荧光, 说明在AdVP22重组病毒感染的AD293细胞中, VP22由原始感染并表达的细胞向周围细胞扩散从而呈现特异的辐射状荧光。为进一步证明, 将感染AdVP22重组病毒的AD293细胞裂解后加至MDBK细胞上, 观察VP22的细胞摄入情况, 结果发现去除裂解产物的MDBK细胞也呈现VP22的特异性荧光染色, 而对照的AdGFP则无此现象, 说明VP22能够进入MDBK细胞, 通过重组人腺病毒载体表达的VP22具有其特有的蛋白转导功能。

  2.4 重组病毒表达的VP22的细胞定位模式差异 IFA检测分时间梯度感染AdVP22重组病毒的AD293细胞, 并以PI对细胞进行染核, 随后以Leica TCS SP2共聚焦显微镜Ar/ArKr 488和514双通道检测, 结果发现AdVP22重组病毒感染24 h后的AD293细胞中, 细胞核呈现PI的红色荧光, 针对VP22的FITC绿色荧光似乎并未定位于细胞核, 而是集中在细胞核边缘(图4A), 感染36 h后, VP22则以特殊的荧光粒子的形式存在于胞质中(图4B), 感染48 h及72 h后VP22仍以荧光粒子的形式存在于胞质中(图4C、 D), 并未进入细胞核。为证实VP22的这种定位模式并非由细胞种类的不同引起, 我们将pcDNAVP22重组质粒转染AD293细胞, 以同样方法荧光检测VP22的定位, 显示瞬时表达的VP22蛋白在AD293细胞上能够高效转导(图5A), 并且细胞核表现出针对VP22的FITC绿色荧光和PI的红色荧光的重叠色, 呈现黄色荧光(图5B), 说明瞬时表达的VP22在AD293细胞上定位于细胞核, 不同于AdVP22感染的AD293细胞表达的VP22的定位。同时为验证VP22的荧光粒子形式是否由VP22向病毒粒子组装形成, 设置了AdGFP感染的AD293细胞的对照, 发现GFP的自发荧光主要定位在细胞质中, 并未以荧光粒子形式出现(图5C), 说明上述观察到的VP22的荧光粒子形式并非由VP22组装至病毒粒子所致。

  3 讨论

  我们通过人腺病毒系统表达MDV1的VP22蛋白, 发现在重组病毒感染的AD293细胞上, 即便是在受染细胞的临周细胞中, 转导进入的VP22并未呈现很强的细胞核定位, 而是首先趋于核膜定位, 随后以荧光粒子的形式散在于细胞质中, 这一现象同Elliott等[9]的结果极其相似, 但值得商榷的是, Elliott等观察到单个细胞内的荧光粒子的数量要比我们的多的多, 并且随着时间的推移在细胞间隙也能观察到大量的荧光粒子, 他们认为是蛋白组装入病毒粒子的结果。而我们所观察到的单个细胞内的荧光粒子数量仅在1至2个, 不是病毒粒子形式, 这一点也已经用AdGFP感染的对照证实。

  我们先前已经证实, 在MDV感染的CEF中, VP22呈现很强的细胞间转导及细胞核定位[5], 那么为什么同样的蛋白在人腺病毒表达系统中表现出迥异的细胞定位状态?为什么VP22会聚集成荧光粒子?对于这一问题, Normand等[10]将表达HSV VP22羧基末端159301aa的基因片段插入到原核表达载体pET24b中表达并纯化, 随后同硫代寡核苷酸混合, 发现混合物中形成直径0.3~1.0 μm的粒子。将硫代寡核苷酸带上荧光标签并将形成的粒子加入活细胞中, 发现带标签的荧光粒子以较高的效率进入细胞, 并在细胞中存在数天。O’Donnell等[11]将MDV的VP22同GFP的融合蛋白在CEF上表达发现, 该蛋白除能结合微管及细胞的异染色质外, 还具备结合细胞的中心体的特性, 在有丝分裂时, VP22与GFP的融合蛋白结合细胞的姐妹染色单体, 并从中心体及微管形成的纺锤丝上脱落。本实验所观察到的VP22的聚集成粒子的现象, 是否是由于表达过程中VP22同细胞内的某些寡肽结合而导致的蛋白聚集, 亦或是重组病毒感染过程中表达的VP22结合细胞中心体的结果还需进一步实验加以验证。但无论如何, VP22确实改变了其定位模式。

  CPPs的定位对其将来的运用至关重要。目前对于CPPs的转导机制还不明了, 它们的性质和结构各异, 说明不同CPPs可能存在不同的转运机制。在作为转运工具时, 对于不同的转运对象, 被CPPs转运后的细胞定位直接决定了被转运对象能否满足研究和应用的要求。Dowdy等利用分子模型技术(molecular modeling)构建了几类CPPs, 并对它们的转导效率和细胞定位进行了研究, 发现其中一种原先CPPs中的3个精氨酸和2个赖氨酸被丙氨酸代替, 替代后CPPs的转导效率要比原先的高得多, 且定位在细胞质; Kim等[12]通过类似的方法构建了定位于细胞质的CPPs, 称之为胞质转导肽(CTP), 有趣的是, 这类CPPs在体内能有效的将目的蛋白转运至肝和淋巴结, 而天然的CPPs却没有这种功能, 且转运效率较前者要小得多。上述发现, 对于克服基因治疗中存在的靶向运输较难及基因的组织特异性表达等问题意义重大, 所以, 对CPPs细胞定位机制的了解对日后该类物质的应用至关重要。本研究中腺病毒表达的VP22的细胞定位的改变, 为CPPs细胞定位机制的研究提供了数据。VP22核定位功能的丧失及细胞定位的改变, 必定也将拓宽今后VP22的应用范畴。

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