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日志

 
 

CpG ODN序列结构特征对免疫活性影响的研究进展  

2017-03-07 22:38:30|  分类: 抬头望见北斗星— |  标签: |举报 |字号 订阅

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【关键词】  CpG ODN; CpG 基序; 免疫刺激; 序列结构

  CpG ODN(CpG oligonucleotide, CpG 寡脱氧核苷酸)是人工合成的含有非甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(CpG)的寡脱氧核苷酸(ODN), 可模拟细菌DNA刺激多种哺乳动物包括人的免疫细胞。它能直接激活B细胞和单核细胞(巨噬细胞和树突状细胞), 间接激活NK细胞和T细胞等多种免疫效应细胞, 增强其功能和细胞因子的分泌, 增强抗原的加工提呈, 诱导Th1型免疫应答, 产生较强的体液免疫和细胞免疫, 增强特异性和非特异性免疫反应。可治疗肿瘤、 过敏反应性疾病、 感染性疾病和免疫功能低下的患者。国外已对目前对人免疫刺激活性最强的CpG ODN 7909进行了多项的临床试验, 包括对黑色素瘤、 非小细胞肺癌、 皮肤T细胞淋巴瘤、 非霍奇金淋巴瘤等肿瘤的Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ期临床试验, 以及对HBV、 HCV等感染性疾病的Ⅰ/Ⅱ期临床试验[1-3], 证实是一种高效低毒的新型免疫治疗剂和佐剂, 并已申请专利。目前国内的研究尚处于体外实验和动物试验阶段, 尚无具有独立知识产权的CpG ODN序列。
    
  CpG ODN是多个脱氧核苷酸有规律的排列, 其组合形式多样。而不同序列结构特征的CpG ODN免疫活性相差很大, 改变序列中的某一个或某几个核苷酸都可能会极大地影响其免疫活性, 这是设计免疫活性CpG ODN的理论基础。通过研究总结并掌握CpG ODN的构效关系对于合成和筛选对人有效的CpG ODN序列有重要意义。

  1  CpG ODN的结构特征及分类
    
  非甲基化的CpG二核苷酸为核心的六核苷酸特征结构, 即CpG及其上游、 下游各2个核苷酸所组成的六聚体, 是奠定CpG ODN免疫刺激作用的序列元件, 它是CpG ODN免疫刺激活性的核心结构。Krieg称其为CpG基序(CpG motif), Sato等则称其为免疫刺激序列(ISS, immunostimulatory sequences)。根据CpG ODN的骨架结构特点、 免疫活性、 免疫细胞识别特征的差异对其进行分类, 以便深入了解其构效关系, 从而更有针对性地设计具有不同治疗目的CpG ODN。

  1.1  根据骨架分类  CpG ODN有两种骨架: (1)磷酸二酯骨架(phosphodiester, PO), 即相邻的核苷酸以磷酸二酯键相连; (2)硫代磷酸骨架(Phosphorothiate, PS/PTO), 即磷酸二酯键中一个非桥联氧原子被硫取代。这种取代与其细胞摄取能力和抵抗3'端核酸外切酶的消化能力密切相关, 从而影响其活性。

  1.2  根据外周血单个核细胞对CpG核心序列识别特征分类  根据CpG ODN活化人外周血单个核细胞(PBMC)亚群和产生的免疫效应的区别可将其分为两类, 分别称为D型和K型[4]。Krieg将上述两类ODN分别命名为CpGA ODN和CpGB ODN。各型结构特征和免疫效应的区别如表1所示。
    
  近年来, 一种新型的CpG ODN逐渐被人们识别, 这种ODN既能活化B细胞, 诱导人PBMC分泌Ⅰ型IFN, 还可以明显增强PBMC中NK细胞的细胞毒作用。这种ODN被定义为C型ODN, 即CpGC ODN。其结构特征为: (1)5′末端或者靠近5′末端有12个TCG三核苷酸。(2)至少有10~12个碱基构成的回文序列, 最好在3′端, 其中至少有2组CG二核苷酸[5]。(3)由poly T连接。

  表1  3型CpG ODN的比较(略)

  这种分类方法对CpG ODN临床应用具有重要的意义。在进行肿瘤的临床治疗时, 可以根据机体对不同的抗肿瘤机制选择应用不同的CpG ODN 以达到治疗目的: 如果以NK细胞杀伤肿瘤细胞为主要机制, 则选择A型ODN, 如果以诱导记忆性免疫应答及抗瘤抗体的作用为主要机制, 则选择B型ODN[6]。治疗病毒感染性疾病时, 首先选择A型ODN。C型CpG ODN的作用则结合了两者的特点, 在肿瘤和感染性疾病的治疗中具有更广阔的前景。

  1.3  根据其免疫刺激活性进行分类  根据CpG ODN免疫作用的方向可将分为两型: 一型是免疫刺激性CpG ODN (immunostimulatory CpG oligodeoxynucleotides,  CpGS ODN), 另一型是抑制性CpG ODN, 包括中和性CpG ODN(neutralizing CpG oligonucleotides, CpGN ODN)[7]和含有CGGG序列的抑制性ODN[8]。抑制性ODN能够拮抗CpGS ODN的作用。上述研究结果对选择性合成ODN具有指导意义: 如果进行肿瘤的基因治疗, 可以预先去除载体上不影响基因活性的CpGS 基序,  或将其转换为CpGN 基序, 以减轻载体的免疫刺激效应; 如果将ODN作为免疫调节剂或疫苗佐剂使用, 需避免CpGN ODN在序列中出现, 尽量利用CpGS ODN增强其免疫刺激活性。

  2  影响CpG ODN的免疫刺激活性的因素
    
  CpG ODN的免疫刺激活性受自身结构特征影响。CpG二核苷酸的缺失、 逆转以及胞嘧啶的甲基化均可导致其活性丧失, 说明CpG ODN中非甲基化的CpG二核苷酸的存在是其免疫刺激活性的基础。此外, 骨架的长度、 硫代化修饰、 侧翼序列、 末端修饰及二级结构形成等因素对其活性也有影响。

  2.1  骨架结构  (1)骨架长度: CpG ODN需要一定长度才能发挥其免疫刺激活性。许洪林等设计了一系列含15~30个碱基的CpG ODN, 发现富含CpG基序的T7(含21个碱基)和T8(含24个碱基)具有较强的刺激B细胞产生IgM的作用; 含16, 27, 30个碱基的CpG ODN免疫作用较弱。而且, 目前公认对人以及对小鼠免疫刺激作用最强的CpG 7909(即CpG 2006)和CpG 1826分别含24个和20个碱基。综上, 可以推测长度为18~25个碱基左右的含有非甲基化的CpG基序的CpG ODN可以较好地发挥其免疫刺激活性, 目前国内外研究中又以20~24个碱基长度的CpG ODN多见。(2)骨架的化学修饰: 寡脱氧核苷酸骨架修饰中最常见、 应用最广泛的是硫代化修饰, 即磷酸二酯骨架中一个非桥联氧原子被硫取代。因磷酸硫代化修饰可抵抗体内核酸酶的消化作用, 有利于其在体内保持稳定; 并且增加胞内的吸收率, 从而加强其免疫活性。研究证实[9], PS骨架的CpG ODN (PSODN)浓度仅为PO骨架的CpG ODN (POODN)的1/10~1/100时即可表现出强度相当的免疫活性, 如诱导NO分泌、 缺乏集落刺激因子1(macrophage growth and survival factor,  CSF1)时维持细胞活性、 活化IL12启动子等。而且PSODN刺激B细胞增殖作用强于相应的POODN。在诱导小鼠脾细胞分泌IL12和表达CD69方面, PSODN也强于POODN[10]。值得注意的是, PSODN在高浓度时反而表现出一定的抑制效应, 这在POODN是不存在的[9]。PSODN可引起小鼠脾脏肿大, 可能与髓外造血和免疫系统的过度激活有关, 尚未发现有文献报道POODN的类似作用。所以, 在设计具有免疫刺激活性的CpG ODN时, 可以对ODN骨架进行硫代化修饰以增强其免疫活性, 但需仔细研究最适剂量, 以获得最佳治疗效果和最低毒副作用。

  2.2  侧翼序列  组成CpG基序的核苷酸六聚体中, CpG二核苷酸两侧的其他核苷酸称为侧翼序列。通过调整侧翼序列中的碱基可以改变其免疫活性。(1)碱基的顺序: Krieg 等[11]发现具有刺激小鼠B淋巴细胞活性的CpG ODN其碱基序列大多有一定规律: CpG二核苷酸近5′端两碱基一般为嘌呤(Purine), 以GpA更佳, 近3′两碱基一般为嘧啶(Pyrimidine), 以TpC或TpT为佳。Ballas等[12]认为CpG二核苷酸近5′端若为C或G可明显抑制ODN刺激小鼠NK淋巴细胞的活性, 而近3′端为C时对活性影响不大。可见, 5′端为GA的GACGTT/C是对小鼠作用较强的CpG基序, 而改为GC或GG后形成了GCCGTT/C或GGCGTT/C基序后, 其免疫活性降低。人外周血单个核细胞可被含有“GTCGTT”, “TTCGTT”, 或“AACGTT”基序激活, 作用最强的基序是GTCGTT。Hartmann等[13,  14]发现多个TCG重复序列有助于增强CpG ODN对人B细胞和NK细胞的刺激作用, 许洪林设计出含多个TCG重复序列的T7和T8, 对人PBMC也具有良好的免疫刺激活性。多个TCG重复序列即形成GTCGTC基序, 说明CpG二核苷酸3′端为TpC时形成的GTCGTC基序同样对人具有较强的免疫刺激活性。(2)碱基的修饰: CpG侧翼序列中特定位点的核糖经2′O或者3′O甲基化修饰后, 其活性发生改变: 修饰靠近CpG的脱氧核苷酸抑制其活性; 而在与CpG 5′端相距3-4个核苷酸位点的修饰则增加了其免疫刺激活性[15]。还有文献报道, 去除CpG寡脱氧核苷酸侧翼序列中的核苷酸上的碱基也可影响其活性: 去除3′端侧翼序列中1~2个特定位置的核苷酸的碱基对其活性影响较小; 而对5′端侧翼序列进行相同的处理能够增强其免疫刺激活性[16]。这些研究都可以用于设计具有更强的刺激活性的ODN, 实用价值尚待进一步验证。

  2.3  末端poly G修饰  CpG ODN两末端的Poly G结构可影响其活性: (1)Poly G为硫代磷酸(PS/PTO)修饰, CpG ODN其余序列为磷酸二酯(PO)骨架时, 5′和/或3′端Poly G均明显增强其活性;  (2)CpG ODN为全硫代磷酸骨架, 5′和/或3′端的Poly G尾抑制其活性。但5′端为Poly G时, 其抑制效应可被增加浓度所克服[12]。

  2.4  CpG基序的频率和位置  对于B型CpG ODN, 单个的CpG基序就足以使这类ODN 表现出活性, 但多个CpG基序的组合(特别是这些CpG基序处于略有差异的侧翼序列中) 将使得其生物学活性极大增高[17]。含有单个CpG基序的ODN和具有多个(≧3)CpG基序的ODN相比, 其最大刺激强度只有后者的1/4(P<0.01)。可见, 含2-4个ISS 的CpG ODN可作为有效的佐剂来增强疫苗的免疫效果。
    
  CpG基序在ODN中所处的位置也影响活性[18]:  (1)CpG基序越靠近5′端时活性越强。(2)5′端有免疫刺激活性较强的CpG基序的ODN, 比起5′端相同位置具有较弱活性的CpG基序的ODN, 前者激发的免疫活化作用显著高于后者(63%: 19%)。如果将免疫刺激活性较强的CpG基序放在3′端则导致活性减弱。这对设计作为免疫佐剂的B型ODN非常重要。为了使其发挥最大的免疫效应, 应该将刺激活性最强的CpG ODN基序放在ODN的5′端。

  2.5  二级结构对活性的影响  Kandimalla等[19]研究发现: (1)5′端形成茎环结构的CpG不能诱导细胞因子的产生; (2)5′端无论是CpG基序区的双链结构还是延伸至全长的双链结构, 诱导IL12和IL6分泌水平大大下降。更长的双链结构尽管增加了CpG基序的含量, 但由于CpG基序形成了双链结构, 对于受体识别CpG基序是不利的, 故而免疫活性也明显减弱。这与以往的研究结果一致, 说明CpG寡核苷酸的5′端是其受体识别和免疫刺激作用的关键部位。他还发现3′端的茎环二级结构能增强CpG刺激小鼠脾细胞增殖的作用, 这可能与3′端的茎环二级结构增加其对3′端核酸酶水解的代谢稳定性有关。综上, 5′端二级结构的出现会使CpG寡核苷酸免疫刺激活性大大降低, 而3′端添加适当的二级结构可增强对免疫细胞的刺激作用。

3  结语
    
  CpG ODN的骨架、 侧翼序列、 末端修饰、 CpG基序的数量和位置、 二级结构等均能影响其免疫刺激活性。各型ODN共同的影响因素如下: (1)序列中含有非甲基化的CpG基序; ⑵必须具备一定的长度, 以18-25个碱基为宜。此外, A型ODN还需要具备⑴磷酸二酯骨架; (2)序列中有回文序列, 能形成二级结构; (3)末端的Poly G结构可以增强其免疫刺激活性。B型ODN则还需要具备(1)全硫代化修饰的骨架; (2)CpG基序位于5′端活性较强; CG二核苷酸5′端相邻的碱基为T时活性最强, 3′端侧翼序列为TpT/TpC/TpA时活性最强。(3)5′端Poly G或二级结构阻断其免疫刺激活性, 3′端Poly G或二级结构可增强其对免疫细胞的刺激作用, 改变细胞因子的分泌情况; (4)多个不同的CpG基序可极大地增强其免疫刺激活性, 特别是处在不同的侧翼序列中。免疫刺激C型ODN对结构的要求与B型相似, 此外其5′端TCG对于高效催生IFNα是必不可少的。
   
  国外研究机构对CpG ODN进行了多项临床试验, 如PF3512676(CpG ODN 7909)治疗黑色素瘤; VaxImmune(CpG ODN 7909)作为疫苗佐剂对非小细胞肺癌进行免疫治疗的Ⅲ期临床试验; 葛兰素史克公司麾下35种疫苗的临床试验, 包括肺癌、 乳腺癌、 前列腺癌及感染性疾病中。我们曾经观察过使用CpG ODN 1826作为免疫佐剂的肿瘤疫苗对急性白血病小鼠模型的免疫治疗效果, 证实应用GpG ODN 1826瘤苗确可加强白血病小鼠的抗瘤作用[20]。CpG ODN免疫刺激作用源于对TLR9的活化, 这启发了科研人员利用TLR调节免疫的思路, 催生出一种新的治疗方法: TLR疗法。2007年10月, 一项联合阻断TLR7、 TLR8、 TLR9治疗自身免疫性疾病的Ⅰ期临床试验开始。此举进一步拓宽了CpG ODN的应用范围。CpG ODN具有相当广阔的前景, 了解并掌握其构效关系将有助于我们设计出更多具有免疫活性的序列。

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