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lican8341的博客

霜剑如梦倚残翼,泊影难觅几何时!

 
 
 

日志

 
 

人BMPR2基因5′侧翼序列生物信息学分析及克隆  

2017-03-07 22:44:27|  分类: 抬头望见北斗星— |  标签: |举报 |字号 订阅

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【摘要】  目的 分析人BMPR2基因5′侧翼序列的特征,预测其潜在的启动子区段,克隆5′侧翼大片断。方法 提取人BMPR2基因的5′侧翼序列,用CpG岛预测软件、重复序列分析软件、启动子预测软件对其进行生物信息学分析,用分段克隆再拼接的方法克隆其5′侧翼近5.5K的大片断。结果 人BMPR2基因属于典型的CpG岛相关基因;有4个可能参与转录调控的Alu序列;有多个潜在的启动子区段。成功构建了重组质粒pGL3Basic5.5K,其插入片断包含人BMPR2基因5′侧翼近5.5 K的序列。 结论 人BMPR2基因5′侧翼大片段的成功克隆及生物信息学预测将为通过实验手段研究该基因的表达调控奠定坚实的基础。

【关键词】  骨形成蛋白Ⅱ型受体;表达调控;生物信息学
  Abstract:Objective To analyze  the sequence feature of the 5′flank region of human BMPR2 gene  and predict the potential promoter region, to clone the large fragment of 5′flank region of this gene. Methods  The 5′flank  region of human BMPR2 gene was subjected to bioinformatics analysis online with CpG islands prediction software,repeat sequence prediction software and promoter prediction software. In order to clone a 5.5K fragment of 5′flank region, two overlapping fragments were amplified separately and linked through successive cloning. Results Bioinformatic analysis showed that human BMPR2 gene was a typical CpG island associated gene, there were four Alu sequences and many potential promoter segments distributing in an approximate 5.5K region around the translation initiation codon. A recombinant plasmid pGL3-Basic-5.5K containing the approximate 5.5K region around the translation initiation codon was constructed. Conclusions  The cloning and bioinformatics analysis of 5′flank region of human BMPR2 gene would lay a solid foundation for the study on the expression regulation of  this gene by experiment.

  Key words:done morphogenetic protein receptor Ⅱ;expression regulation;bioinformatics

  人类BMPRⅡ基因位于2q33~34,其编码蛋白为骨形成蛋白Ⅱ型受体(BMPRⅡ)——属于TGFβ受体超家族的跨膜丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶受体,相应的配体为骨形成蛋白BMPs[1]。研究表明,BMPRⅡ参与了机体众多重要的生命活动过程,包括伤口愈合、骨修复、骨重建[2]、胚胎发育、细胞的分化、迁移、凋亡等[3];BMPRⅡ基因的突变是原发性肺动脉高压的致病原因[4];BMPRⅡ所介导的信号能调控某些癌细胞的生长和转移[5,6]。作为一种重要的信号通路中的受体蛋白,其表达应该是受到精密的调控的,研究其表达调控对于阐明其正常的生理功能和异常的病理机制无疑具有极其重要的意义。本研究对人BMPR2基因5′侧翼序列进行生物信息学分析,并克隆出一个约5.5 K的片断,为进一步通过实验研究人BMPR2基因的表达调控奠定坚实的基础。
    
  1材料与方法

  1.1材料
    
  Takara LA Taq、1Kb DNA Ladder、T4 DNA ligase均购自大连宝生物公司;pGEM3Z、pGL3Basic载体本实验室保存。

  1.2人BMPR2基因5′侧翼CpG岛的分析
      
  截取人BMPR2基因翻译起始密码子ATG之前的5 000 nt和之后的500 nt共5 500 nt的序列利用下列在线软件进行CpG岛预测,为方便起见,将序列5′端第一个碱基定为+1位。

  1.2.1CpG Island Searcher:http://www.uscnorris.com/cpgislands/cpg.cgi其最低限值设置为:GC=55%;ObsCpG/ExpCpG=0.65;Length=500 bp Gap between adjacent islands=100 bp

  1.2.2MethPrimer:http://www.urogene.org/methprimer/index1.html Criteria used:Island size>200, GC Percent > 50.0, Obs/Exp>0.60

  1.2.3cpgplot:http://www.ebi.ac.uk/emboss/cpgplot/其选择参数为:Window=100;Step=1;Obs/Exp=0.6;MinPC=50;Length=200

  1.2.4CpGProD (CpG Island Promoter Detection): http://pbil.univlyon1.fr/software/cpgprod_query.html

  1.3人BMPR2基因5′侧翼重复序列分析
    
  登陆http://www.repeatmasker.org/cgibin/WEBRepeatMasker和 http://tandem.bu.edu/trf/trf.basic.submit.html进行在线重复序列分析,待分析序列同上。

  1.4人BMPR2基因5′侧翼启动子区段预测
    
  利用在线分析软件(相应的名称及网址见表3)对人BMPR2基因翻译起始密码子之前的5 000 nt进行启动子区段和转录起始位点的预测,为方便起见,将序列5′端第一个碱基定为+1位。
    
  1.5人BMPR2基因5′侧翼大片断的克隆
      
  先利用引物P1F:5′TTG GTA CCT AGA AGA AGC AAG CAG AGC ATG ACT 3′和P1R:5′CCA AGC TTA AAT GTC AAG ATA CCA CAC CCA A 3′,以人基因组DNA为模板扩增出2 853 bp的片断, BamHI和HindIII双酶切回收2 532 bp的片断克隆到pGEM3Z载体上构建重组质粒pGEM3Z2.5K;同时利用引物P2F:5′CGG TGA GCT CGT GAG TGA ACA GCC ATG TCC CAA CT3′和P2R:5′CCA CAT CCT TTT GTT CGG CGT TCA GCA GAC TCC TCC 3′,以人基因组DNA为模板扩增出3 586 bp的片断,用SacI和BamHI双酶切回收2.9 K片断作为目的片段,以SacI和BamHI双酶切pGEM3Z2.5K质粒作为线性载体,将上述2.9 K的片断与该线性载体重组、转化JM109感受态细菌,获得重组质pGEM3Z5.5K,其插入片断大小为5 457 bp,相当于人BMPR2基因翻译起始密码子之前的5 106 nt至之后的351 nt.再将该5 457 bp的片断亚克隆到荧光素酶报告载体pGL3Basic中构建重组质粒pGL3Basic5.5K测序予以确证。

2结 果

  2.1人BMPR2基因5′侧翼区的生物信息学分析
      
  CpG岛预测结果见表1,综合几个软件的分析结果表明序列第1 937~5 500位即翻译起始密码子前3 163 nt处到第一内含子的424 nt处广泛地分布着CpG岛。
    
  重复序列分析显示人BMPR2基因5′侧翼区5 500nt的范围内分布着1个MER44C DNA元件、4个短分散重复序列Alu序列、(CCG)n、(GGC)n三核苷酸重复序列及其他重复序列,见表2。

  表1人BMPR2基因5′侧翼CpG岛预测 略

  表2人BMPR2基因5′侧翼重复序列的位置及类型 略

  多种启动子区段及转录起始位点预测软件分析表明,人BMPR2基因5′侧翼翻译起始密码子ATG前5 000 nt的序列中存在多个可能的启动子区段,见表3。

  表3人BMPR2基因5′侧翼启动子区段预测 略
    
  2.2人BMPR2基因5′侧翼大片断的克隆
     
  重组质粒pGL3Basic5.5 K经 SacI+ HindⅢ双酶切,理论上应得到5.5 K 的目的片段和 4.8 K的载体片段,结果与预期相符,结果如图所示。进一步测序表明克隆片段确系人BMPR2基因5′侧翼序列。
    
  图1重组质粒pGL3Basic5.5K的鉴定 略

  3讨 论
      
  转录水平的调节是基因表达最主要的调控环节,启动子是基因表达所必需的序列信号,只有当RNA聚合酶特异地识别并结合到特定基因的启动子部位,才能起始转录,故而确定基因的启动子区段,对基因的转录调控研究具有至关重要的意义。多种启动子区段及转录起始位点预测软件分析表明,人BMPR2基因5′侧翼ATG前5 000 nt的序列中存在多个可能的启动子区段,但考虑到GenBank中现有mRNA序列(登录号:NM_001204,GI:72376969)中5′端第一个碱基距离翻译起始密码子有527nt,综合分析,人BMPR2基因的高度候选启动子区应位于翻译起始密码子之前700~1 500 bp的范围,在此区段极有可能找到具有启动活性的片断从而为下一步通过实验研究该基因的转录调控指明了方向。
       
  生物信息学分析表明,人BMPR2基因5′侧翼存在明显的CpG岛,有报道指出,所有的管家基因/广泛表达的基因及40%的组织特异性表达/有限表达的基因,其转录起始位点周围都存在CpG岛[7],CpG岛可发生甲基化从而钝化转录[8],从而为基因表达调控提供一种机制,因此这些潜在的CpG岛可能在BMPR2基因的转录调控中扮演着重要的角色。重复序列分析表明,人BMPR2基因5′侧翼翻译起始密码子前2 700~4 600 nt的区域内分布4个Alu序列,虽然目前对Alu家族的功能了解还不多,但有报道指出,Alu序列可作为顺式作用元件与转录因子或激素结合,如Alu元件可作为增强子与锌指转录因子Sp1、视黄醛受体、雌激素受体α结合[9],而在CETP基因中,Alu元件则起抑制子的作用[10],因而人BMPR2基因5′侧翼Alu序列是否参与转录调控也是我们未来研究的一个方向。
        
  本研究中,我们还克隆了人BMPR2基因5′侧翼近5.5 K的片断,该片断包括翻译起始密码子之前的5 106 nt和翻译起始密码子之后的351 nt,由于该片断较长,尽管其总体的GC含量为52.6%并不太高,但其GC分布很不均匀,靠近5′端的前2 000碱基GC含量仅为43.3%,而序列后半部分有多个GC含量丰富的CpG岛,其中有一个348 bp的区段,其GC含量高达76.1%,因此要通过PCR一次将该5.5 K的大片断扩增出来非常困难,我们采取了分段克隆再拼接的策略,即先克隆2个有部分重叠的片断再行拼接,最后成功地获得了人BMPR2基因5′侧翼近5.5 K的大片断,为构建缺失突变体通过报告载体精确分析人BMPR2基因5′侧翼的转录调控序列奠定了基础。

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